داستان انیمیشن «روزی روزگاری استودیو»، در یک روز معمولی آغاز می‌شود. همه کارمندان استودیو ترک محل کار خود را کرده و به خانه رفته‌اند. اما مینی و میکی از عکس‌های روی دیوار به شکل‌های زنده درآمده و تصمیم می‌گیرند تمام شخصیت‌های معروف و دوست‌داشتنی از دنیای والت دیزنی را برای یک عکس دسته جمعی تازه به مناسبت جشن صدمین سالگردشان دور هم جمع کنند…